與化學(xué)仿制藥相比，生物類(lèi)似藥雖然也屬于仿制藥范疇，但其不僅投資門(mén)檻更高，技術(shù)門(mén)檻也更高。

　　三大技術(shù)門(mén)檻

　　生物類(lèi)似藥的技術(shù)門(mén)檻高至少表現(xiàn)在三大方面：

　　一是有關(guān)生產(chǎn)、制造過(guò)程和工藝流程。在產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，有多種因素可能會(huì)影響到生物類(lèi)似藥的質(zhì)量，如分子設(shè)計(jì)、表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞株類(lèi)型、翻譯后修飾(PTM)、不純物和污染物、配方和輔料、包裝容器、生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白降解等。

　　二是對(duì)生物類(lèi)似藥在質(zhì)量、安全性和有效性(QSE)等方面進(jìn)行分析檢測(cè)、表征，需要在臨床試驗(yàn)前在蛋白的多種性質(zhì)上與原研藥參考品一致。這種一致性，根據(jù)歐盟EMA的要求需要“相似”(similar)。而根據(jù)美國(guó)FDA的要求則需要“高度相似”(highly similar)。如果是可以自動(dòng)替換(interchangeable)的生物類(lèi)似藥，其要求更高。

　　上面兩大高門(mén)檻對(duì)于中國(guó)藥企而言更是意味著投資的高門(mén)檻，因?yàn)闊o(wú)論是上下游的工藝開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)還是分析方法開(kāi)發(fā)、質(zhì)量檢測(cè)，所需儀器設(shè)備甚至耗材幾乎都需要進(jìn)口。

　　第三個(gè)方面是生物原研藥的專(zhuān)利壁壘。生物藥的專(zhuān)利要遠(yuǎn)比化學(xué)藥復(fù)雜，這個(gè)高門(mén)檻很容易被投資人忽視。艾伯維(Abbvie)和安進(jìn)(Amgen)因Humira(修美樂(lè))的生物類(lèi)似藥的專(zhuān)利之戰(zhàn)僅僅是一個(gè)例子?，F(xiàn)在風(fēng)頭正勁的免疫腫瘤抗體藥(尤其是已經(jīng)上市的兩個(gè)PD-1抗體藥)以后很可能成為被仿制的熱點(diǎn)目標(biāo)，但免疫腫瘤領(lǐng)域近期多起專(zhuān)利訴訟也說(shuō)明：即使是做原研生物藥，專(zhuān)利問(wèn)題也需要防范。

　　出于工作關(guān)系和個(gè)人興趣，筆者本文僅談?wù)勆镱?lèi)似藥的分析技術(shù)。如表格所示，生物類(lèi)似藥的表征分析，涉及許多生物化學(xué)和生物物理技術(shù)，筆者對(duì)于大多數(shù)技術(shù)略知一二，本文無(wú)意具體談這些分析技術(shù)的細(xì)節(jié)和難度，而只是通過(guò)簡(jiǎn)單評(píng)論這些技術(shù)手段，試圖說(shuō)明進(jìn)入生物類(lèi)似藥的門(mén)檻很高。

　　質(zhì)控蛋白三大性質(zhì)

　　與評(píng)價(jià)化學(xué)藥類(lèi)似，對(duì)于生物藥的評(píng)價(jià)，質(zhì)量、安全性和有效性可以說(shuō)是最重要的三個(gè)方面，而質(zhì)量又是安全性和有效性的前提和基礎(chǔ)。

　　對(duì)于生物藥的質(zhì)量，F(xiàn)DA認(rèn)為治療性蛋白的三大方面性質(zhì)雖然不能被完全充分測(cè)定，但對(duì)于評(píng)價(jià)蛋白藥是非常重要的，這三大性質(zhì)即：PTM、蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白聚集，下面將分別簡(jiǎn)單介紹。

　　蛋白的翻譯后修飾(PTM)

　　蛋白的翻譯后修飾(PTM)有很多種，常見(jiàn)的包括糖基化(又可細(xì)分為：半乳糖苷基化、巖藻糖基化、唾液酸糖苷化等)、氧化、磷酸化、硫酸化、脂化、二硫鍵形成和脫酰胺。這些化學(xué)變化大多是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的，但有些也可能發(fā)生在生產(chǎn)的各個(gè)階段(如純化和儲(chǔ)存過(guò)程)。

　　現(xiàn)在的科學(xué)研究已經(jīng)表明，蛋白的PTM會(huì)影響蛋白的活性和免疫原性。蛋白的PTM還可能改變蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而引起聚集，從而進(jìn)一步影響蛋白的免疫原性。

　　因此，需要在蛋白類(lèi)藥物生產(chǎn)的各個(gè)階段對(duì)蛋白質(zhì)的PTM進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于單一成分的純化蛋白藥，PTM的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)則相對(duì)容易一些。而對(duì)于含有許多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物蛋白藥物(如有些預(yù)防性疫苗)，即使是采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)所有蛋白的PTM也是非常大的挑戰(zhàn)。

　　研究蛋白PTM的最有力的利器當(dāng)是生物質(zhì)譜了，主要是基于電噴霧(ESI)和基質(zhì)輔助激光解離(MALDI)兩種技術(shù)。近年來(lái)，質(zhì)譜在生物類(lèi)似藥領(lǐng)域的應(yīng)用明顯增多，在近幾年的美國(guó)質(zhì)譜協(xié)會(huì)會(huì)議上，每年都有不少口頭報(bào)告或墻報(bào)是直接用質(zhì)譜研究生物類(lèi)似藥PTM的，其中糖基化研究占比最大。

　　但是，由于生物質(zhì)譜價(jià)格昂貴，動(dòng)輒幾十萬(wàn)美元，高端的售價(jià)甚至在50萬(wàn)美元以上，這也限制了生物質(zhì)譜在包括生物類(lèi)似藥在內(nèi)的生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

　　蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)

　　蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)特性決定了蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而最終決定了蛋白的功能和活性。因此，比較生物類(lèi)似藥(指蛋白藥)和原研藥的蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，是證明兩只藥相似的重要手段。

　　X-射線(xiàn)衍射和核磁共振(NMR)是公認(rèn)的測(cè)定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)的兩種最主要的技術(shù)。但是，對(duì)于生物類(lèi)似藥和原研藥的結(jié)構(gòu)相似性研究，這兩種技術(shù)都有很大的挑戰(zhàn)。

　　對(duì)于X-射線(xiàn)衍射而言，需要耗時(shí)較長(zhǎng)的蛋白結(jié)晶過(guò)程和數(shù)據(jù)解析過(guò)程，對(duì)于樣品量較大的工業(yè)界而言，顯然不能滿(mǎn)足高通量的要求。而NMR不但價(jià)格昂貴、靈敏度相對(duì)較低、數(shù)據(jù)分析耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)于分析分子量達(dá)150kDa的大分子抗體藥也面臨很大的挑戰(zhàn)，所以NMR在生物類(lèi)似藥領(lǐng)域注定應(yīng)用非常有限。

　　另外，還有其它一些經(jīng)典生物物理技術(shù)被用于表征蛋白的結(jié)構(gòu)，如圓二色性譜、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、差示掃描量熱法、分析超速離心、排阻色譜以及各種染料結(jié)合鑒別技術(shù)等。這些技術(shù)一個(gè)最主要的限制，就是只能檢測(cè)來(lái)自蛋白不同部位的某一種總的信號(hào)。從這些測(cè)定得到的信息只能得到生物藥整個(gè)結(jié)構(gòu)的總的平均值。比如：圓二色性譜測(cè)定就只能表明某一種主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)(阿爾法螺旋、b折疊和無(wú)規(guī)卷曲)的平均百分比。如果一個(gè)含有多個(gè)阿爾法螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，其中只有一個(gè)阿爾法螺旋結(jié)構(gòu)和另一蛋白相比發(fā)生了變化，但是即使這一變化相對(duì)較大，被另外不變的阿爾法螺旋平均以后，圓二色性譜所能測(cè)到的變化也可能很小，甚至沒(méi)有可以測(cè)量出的變化。所以這些經(jīng)典生物物理技術(shù)不能用于檢測(cè)生物藥很小的結(jié)構(gòu)變化。

　　更靈敏的技術(shù)則是氫氘交換質(zhì)譜(HDX-MS)，這也進(jìn)一步顯示質(zhì)譜技術(shù)在比較生物類(lèi)似藥和原研藥結(jié)構(gòu)方面的重要性?，F(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)在生物藥領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)遠(yuǎn)不僅僅是做蛋白質(zhì)鑒定、分子量測(cè)定、氨基酸序列測(cè)定，蛋白結(jié)構(gòu)只是其多種新應(yīng)用的一個(gè)方面。

　　蛋白聚集

　　蛋白聚集是蛋白藥生產(chǎn)過(guò)程中很頭疼的問(wèn)題，尤其是對(duì)于高濃度的蛋白溶液，很容易引起蛋白聚集。單體蛋白的聚集過(guò)程可以是可逆的，也可能是不可逆的，其聚集后的大小可以從二聚體到包含上萬(wàn)億個(gè)蛋白單體的肉眼可見(jiàn)的顆粒。

　　總的來(lái)說(shuō)，蛋白聚集對(duì)于任何蛋白藥都是問(wèn)題。蛋白聚集不但會(huì)降低蛋白藥的有效劑量，更大的問(wèn)題是可能會(huì)引起毒副作用和免疫反應(yīng)。一般而言，蛋白分子量越大，其免疫原性越強(qiáng)。在某些特殊情況下，這些難以預(yù)料的副作用甚至可能是致命的。

　　因此，蛋白聚集必須被檢測(cè)、定量和表征，用以比較生物類(lèi)似藥和原研藥。如表中所示，表征蛋白聚集的主要分析技術(shù)包括排阻-高效(壓)液相色譜(SEC-HPLC)、凝膠電泳、分析超速離心、光散射法等。

　　由于簡(jiǎn)單、易用、廉價(jià)、快速、樣品用量少等特點(diǎn)，SEC-HPLC是目前檢測(cè)蛋白聚集的最常用方法。當(dāng)然，SEC-HPLC也有自己的缺點(diǎn)，如較大的蛋白聚體可能在進(jìn)樣上柱時(shí)就被除去，造成假陰性。

　　這也進(jìn)一步說(shuō)明，沒(méi)有任何一種十全十美的分析技術(shù)。正是緣于此，美國(guó)FDA和ICH(國(guó)際人用藥注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議)都建議生物類(lèi)似藥研發(fā)企業(yè)不但要檢測(cè)蛋白不同種性質(zhì)，也建議采用多種技術(shù)檢測(cè)同一種性質(zhì)，以盡量得到更全面的生物類(lèi)似藥和原研藥可以比較的多種信息，如理化性質(zhì)、生物活性、免疫化學(xué)性質(zhì)、純度、不純物和污染物等。

　　相似度界定：Case By Case?

　　值得一提的是，生物類(lèi)似藥有兩個(gè)常用且易于混淆的概念：可比性(comparability)和相似性(similarity)。

　　ICH明確定義和限制“可比性”是指同一家生產(chǎn)商所生產(chǎn)的原研藥(包括批準(zhǔn)上市后階段)，在生產(chǎn)工藝變化(如放大)后，兩種工藝所生產(chǎn)的同一產(chǎn)品(當(dāng)然不可能100%相同)的可比性(參見(jiàn)ICH Q5E指導(dǎo)性文件：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process，生產(chǎn)過(guò)程變化后生物工程/生物產(chǎn)品的可比性)。而“相似性”則是生物類(lèi)似藥生產(chǎn)商仿制的生物藥與原研藥生產(chǎn)商制造的參考品相比較而言的。

　　根據(jù)ICH的定義，“可比性”概念是不可用于生物類(lèi)似藥的。但事實(shí)上，“可比性”和“?