標(biāo)準(zhǔn)曲線的本質(zhì)

　　分析檢測中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是指一系列已知含量(濃度/量)的物質(zhì)與儀器響應(yīng)/信號之間的關(guān)系，數(shù)學(xué)處理就是曲線方程，圖形表示就是標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測物質(zhì)的含量。當(dāng)我們得到一系列已知含量的物質(zhì)的響應(yīng)后，就會去建立函數(shù)關(guān)系，數(shù)學(xué)上稱曲線擬合，由于直線最為簡單，所以常常用直線方程加以擬合，實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可當(dāng)然會用到多項(xiàng)式擬合等其他方式。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的核心問題要解決：

　　1.能找到確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品;

　　2.標(biāo)準(zhǔn)系列和待測物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因?yàn)闃悠坊w可能會干擾儀器的響應(yīng)，從這個(gè)意義上講，樣品的前處理實(shí)際就是提供標(biāo)準(zhǔn)和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最好的標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)該是樣品基體匹配的標(biāo)準(zhǔn)系列。而方法建立過程中首先要考慮的當(dāng)然是基體干擾的問題，推薦用標(biāo)準(zhǔn)加入曲線和Youden曲線分別考察樣品基體所帶來的乘積性干擾和加和性干擾。標(biāo)準(zhǔn)加入曲線就是在樣品中加入一系列標(biāo)準(zhǔn)，然后考察該標(biāo)準(zhǔn)加入曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，若有差異需考慮用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量;而Youden曲線就是對樣品做一系列稀釋，然后用稀釋倍數(shù)如1/10、1/5、1/2、1對儀器響應(yīng)做曲線，考察該Youden曲線的截距與0的差別，若有差別則提示有加和性干擾，此時(shí)測定值要減去該截距才是真實(shí)值。只有解決了標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品基體的匹配問題，我們的定量才可靠。內(nèi)標(biāo)法和替代物的使用則是為了解決儀器和前處理的影響問題;

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的做法

　　按GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》推薦：

　　1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的被測量范圍;

　　2.標(biāo)準(zhǔn)樣品的組分盡量與被測樣品組分一致;

　　3.標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距離的分布在被測量范圍;

　　4.標(biāo)準(zhǔn)樣品的個(gè)數(shù)至少應(yīng)有3個(gè)濃度;

　　5.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)2次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開始;

　　如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按國家標(biāo)準(zhǔn)，如果你要偷懶，比如我要減少標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，至少要有理論標(biāo)準(zhǔn)支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫€性方程最為簡潔。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)是實(shí)際操作中最大的難點(diǎn)，也是工作中誤區(qū)和爭議最多的話題，比如，GB/T 5750.3-2006就將標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)分為：精密度檢驗(yàn)，截距檢驗(yàn)和斜率檢驗(yàn)，但，并未出示具體的檢驗(yàn)方法。首先講講這三個(gè)檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的精密度檢驗(yàn)，實(shí)際含義就是做出來的試驗(yàn)點(diǎn)在我擬合的直線方程左右的分布情況，標(biāo)準(zhǔn)曲線是所有點(diǎn)以最小二乘算法(OLS)擬合出來的，這條曲線到所有點(diǎn)的垂直距離的和(殘差)是最小的。

　　因此，這條曲線并非通過所有點(diǎn)而是非常接近所有點(diǎn)，精密度檢驗(yàn)就是看這些試驗(yàn)點(diǎn)距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗(yàn)(擬合檢驗(yàn))。這時(shí)的精密度(線性檢驗(yàn))需用F檢驗(yàn)，P<0.05作為線性檢驗(yàn)合格的標(biāo)準(zhǔn)。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距檢驗(yàn)和斜率檢驗(yàn)分別考察Y=a+bX中a和b與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，a與0有差別說明有試劑空白或系統(tǒng)誤差，而b若與0沒差別說明儀器的靈敏度根本達(dá)不到分析要求。日常工作中我們通常用相關(guān)系數(shù)來作為標(biāo)準(zhǔn)曲線好壞的標(biāo)準(zhǔn)，這點(diǎn)有一定道理，但并不全面。

　　決定系數(shù)是相關(guān)系數(shù)的平方，就是我們經(jīng)常在儀器軟件中看到的R2或Fit，它提示的是我建立的回歸方程所解釋X對Y變化占Y變量的比值，比如決定系數(shù)是0.99也就是說我這個(gè)回歸方程可以解釋Y變化的99%，剩下的1%就是殘差。前面提到的精密度(線性檢驗(yàn))就是用這兩部分的變化做F檢驗(yàn)，由于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值比較大，通常0.90以上的相關(guān)系數(shù)都會通過這個(gè)F檢驗(yàn)，當(dāng)然還與實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)(自由度)有關(guān)。

　　這里要提到GB/T22554-2010《基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn)》中關(guān)于失擬檢驗(yàn)的問題，這里的失擬檢驗(yàn)是要看曲線擬合后剩下殘差與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)本身隨機(jī)誤差(變異)之間的差別，同樣采用F檢驗(yàn)，此時(shí)失擬檢驗(yàn)P應(yīng)該>0.05，也就是說殘差應(yīng)該跟實(shí)驗(yàn)測定中的隨機(jī)誤差(變異)沒有差別，你要看每次測定的隨機(jī)誤差(變異)就必須多次測定同一濃度，因此失擬檢驗(yàn)要求每個(gè)濃度點(diǎn)至少重復(fù)2次。

　　除此之外，最后我們還要看看這些殘差的分布是否是正態(tài)的，因?yàn)椋龖B(tài)才符合隨機(jī)誤差的特性。綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)應(yīng)該是線性檢驗(yàn)結(jié)合失擬檢驗(yàn)，以及殘差的正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)合才是統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較完備的。

　　通常我們采用的相關(guān)系數(shù)0.99以上的說法缺乏統(tǒng)計(jì)完備性。正如大家經(jīng)常看到的改變擬合的參數(shù)個(gè)數(shù)，如二次方程明顯能提高相關(guān)系數(shù)，但是我們經(jīng)常沒有勇氣去用二次曲線方程，因?yàn)槟銢]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上完備的支撐。如果你發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度和高濃度點(diǎn)的變異程度不同(非等方差)，此時(shí)你應(yīng)該考慮權(quán)重最小二乘(WLS)。

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線使用中的問題

　　1.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要人為的增加(0,0)點(diǎn)嗎?

　　不能。通常的標(biāo)準(zhǔn)系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實(shí)驗(yàn)人為添加(0,0)很不妥，因?yàn)楹芏鄷r(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應(yīng)值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標(biāo)準(zhǔn)系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒做實(shí)驗(yàn)人為添加(0,0)，那你就很難做好標(biāo)準(zhǔn)曲線。所以標(biāo)準(zhǔn)曲線的0管也是做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的重要考慮點(diǎn)。

　　2.標(biāo)準(zhǔn)曲線需要減掉試劑空白來做嗎?

　　不需要。儀器測出來標(biāo)準(zhǔn)系列的響應(yīng)值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應(yīng)值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調(diào)零。其實(shí)沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應(yīng)值，在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們已經(jīng)認(rèn)為該響應(yīng)值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。

　　3.什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線呢?

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，且要做統(tǒng)計(jì)完備的線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，然后再做a與0的差別檢驗(yàn)，如果a與0的統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)，如果線性檢驗(yàn)合格(P<0.05)且失擬檢驗(yàn)合格(P>0.05)此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗(yàn)，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上參數(shù)最少的統(tǒng)計(jì)簡潔性原則。

　　4.標(biāo)準(zhǔn)曲線去查含量時(shí)是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢?

　　工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現(xiàn)，在低含量水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量，因?yàn)檫@樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標(biāo)準(zhǔn)曲線推算含量時(shí)的不確定度，因?yàn)楹玫臏y量永遠(yuǎn)是不確定度小的測量。

　　5.如何做兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)?zāi)?

　　先從原理上講：判斷兩條或多條標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異，須檢驗(yàn)殘差，截距和斜率三項(xiàng)，分別有不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，殘差用F檢驗(yàn)，截距和斜率采用較為復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)量。2、從實(shí)際操作講：多用協(xié)方差分析檢驗(yàn)截距和斜率的差異，以SPSS為例：1.先重新整理數(shù)據(jù),將y2數(shù)據(jù)列加到y(tǒng)1下面,變成一個(gè)變量y;將x2數(shù)據(jù)列加到x1下面,變成一個(gè)變量x;然后再設(shè)定一個(gè)新的分組變量group,原來第1組值為1,第2組值為2. 2.進(jìn)行協(xié)方差分析(第一步分析斜率是否無差異).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y---------將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x--------將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x groupx*group---------注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會不一樣. Sum ofsquares下拉列表框:選TypeI 然后點(diǎn)擊ok,看結(jié)果里x*group這一行的Sig.P值,若大于0.05,則接受原假設(shè),即兩條回歸直線的斜率無差異,否則拒絕. 3.再來進(jìn)行截距的無差異分析其實(shí)過程跟上面一樣,只是Model里去掉了x*group交叉項(xiàng).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y---------將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x--------將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x group ---------注意如果變量填入順序不一樣,結(jié)果也會不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI 點(diǎn)擊ok后,看group一行的Sig.P值,若P值大于0.05說明兩條回歸直線截距也無差異,若小于0.05說明截距是有差異的。

　　6.標(biāo)準(zhǔn)系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用中有效數(shù)字該如何寫呢?

　　標(biāo)準(zhǔn)溶液體積取用的有效數(shù)字跟你采用的體積量具有直接關(guān)系。比如說量取或準(zhǔn)確量取等字眼，10mL和10.0mL提示你要采用不同的量具。當(dāng)我們使用某個(gè)量具完成某次體積取用后，讀數(shù)是按照量具的最小允差決定的，而最小允差是針對最小分度線而言的。當(dāng)取用10mL體積時(shí)，如果用A級10mL的分度吸管，那么10.0mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.1mL。當(dāng)取用1mL體積時(shí)，如果用A級1mL的分度吸管，那么1.00mL應(yīng)該是確定的，因?yàn)樗姆侄染€為0.01mL。所以我個(gè)人意見，到底寫10.00還是10.0以最小分度線來確定，最小分度線以下的都為估讀。如果你認(rèn)為估讀也是有效數(shù)字的話，10.00mL也可以，因?yàn)榇藭r(shí)的容量允差為0.05mL，但1.000mL就沒有太大意義了，因?yàn)锳級1mL的分度吸管的容量允差已經(jīng)是0.008mL了。

　　7.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字該如何保留呢?

　　GB5750.3-20068.2.7項(xiàng)有如下規(guī)定：校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)只舍不入，保留到小數(shù)點(diǎn)后出現(xiàn)非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數(shù)點(diǎn)后都是9時(shí)，最多保留小數(shù)點(diǎn)后4位。

　　8.標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用同一濃度不同體積的進(jìn)樣來做嗎?

　　標(biāo)準(zhǔn)系列一般都是配制不同濃度，進(jìn)樣相同體積來做的(濃度法)。但實(shí)際工作中我們還用到同一濃度來進(jìn)樣不同體積的方式來做(體積法)，濃度法與體積法的區(qū)別在于濃度法中與待測物質(zhì)存在的溶劑/待測物質(zhì)的比例與體積法不同。濃度法中溶劑的環(huán)境(體積)基本是一致的，這樣的好處就是濃度法在判斷溶劑(或溶劑中干擾物質(zhì))和待測物質(zhì)的指認(rèn)上更加容易。體積法中干擾物質(zhì)也會隨標(biāo)準(zhǔn)系列增加，不容易實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的指認(rèn)。從進(jìn)樣針，進(jìn)小體積時(shí)不確定度比較大，帶來的直接結(jié)果時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不如濃度法容易做直。而且物理體積的限制，體積法不太容易實(shí)現(xiàn)較大跨度的濃度系列設(shè)置?？傊?，體積法和濃度法本質(zhì)上是一致的，但濃度法有：容易做好標(biāo)準(zhǔn)曲線，容易實(shí)現(xiàn)較大濃度跨度和容易實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的指認(rèn)等優(yōu)點(diǎn)。

　　9.標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品是負(fù)值，如何報(bào)告結(jié)果呢?

　　這種情況下我們一般選擇四種方式報(bào)告結(jié)果：未檢出，<檢出限，<定量限，<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度。四種都有道理，實(shí)際區(qū)別是埋在四種選擇下面的結(jié)果報(bào)告人的風(fēng)險(xiǎn)。未檢出的全部含義應(yīng)該是本實(shí)驗(yàn)室本儀器本方法未檢出，如果沒有這些界定，未檢出的歧義很多，而且沒有提供其它任何可用的信息。所以我建議學(xué)生一般不采用這種報(bào)告方法;檢出限是定性檢出的標(biāo)志，它是跟空白的統(tǒng)計(jì)比較計(jì)算出來的。每臺儀器，每次測定都有其檢出限，檢出限計(jì)算目前有兩大類計(jì)算方法：單濃度方法和校正設(shè)計(jì)法(Anal.Chem.1997,69:3069)，常規(guī)采用的單濃度方法需要額外的工作，所以現(xiàn)在趨向用校正設(shè)計(jì)法，既利用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接計(jì)算檢出限，但檢出限I類和II類錯(cuò)誤皆控制在0.05。

　　定量限是可以定量檢出的標(biāo)志，其RSD定為10%，其II類錯(cuò)誤比檢出限小很多。<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度，是我們儀器比較可信的測定濃度?？傊?，報(bào)告<檢出限，<定量限，<標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所推算的樣品濃度所犯I類和II類錯(cuò)誤依次降低，但如果這個(gè)報(bào)告結(jié)果已經(jīng)超過你要判斷的限值，那么你的檢測就一點(diǎn)意義都沒有了。所以現(xiàn)在的檢測單位甚至直接報(bào)告小于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限值，從概率統(tǒng)計(jì)的角度講，它犯錯(cuò)誤的幾率最小，但又解決了客戶的檢測問題。

　　10.空白測出來是負(fù)值，該不該減呢?

　　空白代表你所選擇的空白對儀器響應(yīng)/信號的影響，當(dāng)然可能是正方向和負(fù)方向的影響，所以理論上講必須減掉空白。至于是先減空白信號，還是減空白測定值，按國家規(guī)定或參見4問題。

　　11.線性范圍(動態(tài)范圍)的最低點(diǎn)和最高點(diǎn)如何確定呢?

　　配置一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)，包括0濃度，從低濃度開始擬合當(dāng)擬合檢驗(yàn)出現(xiàn)P>0.05的最高的那個(gè)濃度點(diǎn)為止。有也經(jīng)驗(yàn)說當(dāng)加入的高濃度點(diǎn)在低濃度點(diǎn)構(gòu)建的直線方程推算的響應(yīng)超出±10%范圍。關(guān)于線性范圍的最低點(diǎn)應(yīng)該是0、檢出限或是定量限的問題，個(gè)人趨向最低點(diǎn)為0，因?yàn)榫€性范圍只是統(tǒng)計(jì)學(xué)上線性的表現(xiàn)，跟能否準(zhǔn)確定量是兩方面的問題。